Chiếc 314 đầu tiên, Honolulu Clipper, bước vào hoạt động thường xuyên trên tuyến San Francisco-Hong Kong vào tháng 1 năm 1939. Chuyến bay một chiều trên tuyến đường này mất khoảng 6 ngày để hoàn thành. Dịch vụ hành khách thương mại kéo dài ít hơn 3 năm, kết thúc khi Mỹ nhảy vào Thế chiến thứ 2.

Trong sự bùng nổ chiến tranh ở vùng Thái Bình Dương, chiếc Pacific Clipper đang trong chuyến bay tới New Zealand. Thay vì mạo hiểm bay về Honolulu và để bị bắn bởi máy bay Nhật, chiếc máy bay đã quyết định bay về hướng Tây tới New York. Bắt đầu từ ngày 8 tháng 12 năm 1941 ở Auckland, New Zealand, chiếc Pacific Clipper bao phủ hơn 8.500 dặm từ Surabaya, Karachi, Bahrain, Khartoum và Leopoldville. Chiếc Pacific Clipper hạ cánh tại cơ sở thủy phi cơ tại Sân bay LaGuardia Field của Pan American vào lúc 7:12 sáng 6 tháng 1 năm 1942.

Chiếc Yankee Clipper bay sang bên kia Đại Tây Dương trên tuyến bay từ Southampton tới New York với những điểm dừng trung gian tại Foynes, Ireland, Botwood, Newfoundland và Shediac, New Brunswick. Chuyến bay đầu tiên xảy ra vào ngày 24 tháng 6 1939.

Đội bay Clipper bị ép vào dịch vụ quân sự trong thời gian Thế chiến thứ 2, và những chiếc máy bay được sử dụng để vận chuyển công chức, lực lượng và thiết bị tới mặt trận châu Âu và Thái Bình Dương. Những chiếc máy bay này có số hiệu C-98. Vào năm 1943, Tổng thống Franklin D. Roosevelt đi tới hội nghị Casablanca trên một chiếc 314. Winston Churchill cũng từng bay trên máy bay vài lần, thêm vào sự nổi tiếng của nó trong thời kỳ chiến tranh.

Sau chiến tranh vài chiếc Clipper quay trở lại với Pan American, nhưng loại đó đã trở nên lỗi thời bởi những chiếc máy bay đất liền đường dài mới, như chiếc Douglas DC-4 và Lockheed Constellation, và bởi thời gian chiến tranh việc xây dựng mạng lưới những bãi đáp máy bay đã được sử dụng cho gần cả thế giới. Chiếc 314 bị loại ra khỏi dịch vụ bay lịch trình từ năm 1946 và không cho bay cố định vào năm 1950. Trong số 12 chiếc được lắp ráp, 3 chiếc bị mất do tai nạn, cho dù chỉ có 1 tai nạn mà kết quả là tử vong với 24 người chết ở Lisbon, Bồ Đào Nha vào ngày 22 tháng 2 năm 1943.

Ngoại trừ một vài mảnh kim loại của chiếc máy bay sau khi bị loại bỏ được trưng trong bảo tàng, không còn một dấu vết nào còn lại của 12 chiếc Boeing 314.